Dwa tygodnie po przemówieniu w Algierze Guevara zrezygnował z życia publicznego, a następnie zniknął całkowicie. Naciskany przez międzynarodową opinię publiczną Castro oświadczył w dniu 16 czerwca 1965 roku, że Guevara sam zrezygnował z funkcji publicznych. W dniu 3 października 1965 roku Castro publicznie ujawnił list, rzekomo napisany do niego przez Guevarę kilka miesięcy wcześniej, w którym Guevara podtrzymał swoją solidarność z rewolucją kubańską, ogłosił jednak zamiar opuszczenia Kuby i prowadzenia walki rewolucyjnej za granicą. Dodatkowo rezygnował ze wszystkich swoich stanowisk w rządzie i partii oraz wyrzekał się honorowego obywatelstwa kubańskiego.
Na początku 1965 roku Guevara wyjechał do Afryki, aby służyć swoją wiedzą i doświadczeniem partyzantom walczącym w Kongo. Guevara prowadził kubańską operację wsparcia ruchu marksistowskiego „Simba”, który powstał w trakcie kryzysu w Kongo. Guevara i dwunastu innych kubańskich oficerów przybyło do Kongo 24 kwietnia 1965 roku. Wkrótce potem dołączył do nich kontyngent złożony ze stu Afro-Kubańczyków. Przez pewien czas współpracowali z partyzantką, na czele której stał Laurent-Désiré Kabila, zwolennik obalonego i zamordowanego prezydenta Patrice’a Lumumby. Kontyngent musiał walczyć zarówno z białymi najemnikami z RPA pod wodzą Mike’a Hoare, jak i armią rządową wierną dyktatorowi Mobutu Sese Seko. Najemnicy byli wspomagani przez CIA i środowisko kubańskich wygnańców. Najemnicy mieli udaremnić uderzenie Guevary w górach w pobliżu miejscowości Fizi nad jeziorem Tanganika. Mimo że Guevara dążył do ukrywania swojej obecności w Kongo, rząd USA był świadomy jego miejsca pobytu i działalności.
20 listopada 1965, w złym stanie zdrowia spowodowanym ostrą astmą i zniechęcony siedmioma miesiącami frustracji i braku aktywności, Guevara opuścił Kongo razem ze swoją dwunastoosobową kolumną. W pewnym momencie myślał o samotnym powrocie do Konga i walce do śmierci, aby dać przykład innym rebeliantom. Ponieważ nie chciał wracać na Kubę, spędził sześć miesięcy mieszkając potajemnie w Dar es Salaam [Mozambik] i Pradze. W tym czasie opracował swoje wspomnienia z Konga i szkicował projekty dwóch kolejnych książek, jedna miała być poświęcona ekonomii, druga – filozofii. Następnie odwiedził kilka krajów Europy Zachodniej, aby sprawdzić swoje fałszywe dokumenty tożsamości zrobione przez kubański wywiad. Potajemnie wrócił na Kubę, aby odwiedzić Castro i zobaczyć swoją żonę, na miejscu napisał ostatni list do swoich pięciorga dzieci.
Pod koniec 1966 roku miejsce pobytu Guevary nie była jeszcze powszechnie znane, choć przedstawiciele ruchu niepodległościowego Mozambiku, FRELIMO, poinformowali, że spotkali się z Guevarą pod koniec 1966 w Dar es Salaam. W swoim przemówieniu na wiecu z okazji Międzynarodowego Święta Pracy w Hawanie w 1967 roku minister sił zbrojnych, major Juan Almeida, ogłosił, że Guevara jest w „służbie rewolucji gdzieś w Ameryce Łacińskiej”. Zanim Che wyjechał do Boliwii zmienił swój wygląd, goląc brodę i zmieniając fryzurę tak, aby nie został rozpoznany jako Ernesto Guevara. W dniu 3 listopada 1966 roku Guevara potajemnie przybył do La Paz pod nazwiskiem Adolfo Mena González, udając urugwajskiego biznesmena w średnim wieku pracującego dla Organizacji Państw Amerykańskich.
Pierwszy obóz Guevary znajdował się w lesie w odległym zakątku Nancahuazú. Planując rozpocząć kampanię partyzancką przeciwko juncie wojskowej generała Rene Barrientos, Che razem z „Tanią” utworzył liczący pięćdziesiąt osób oddział partyzancki nazwany Armią Wyzwolenia Narodowego. W skład oddziału wchodziło początkowo dwudziestu dziewięciu Boliwijczyków, dwunastu Kubańczyków i kilku innych cudzoziemców. Czołowymi działaczami Armii byli bracia „Coco” i „Chato” Peredo, młodzi działacze związani z Komunistyczną Partią Boliwii; komisarzem politycznym oddziału został Inti Peredo. Armia była dość dobrze zorganizowana i uzbrojona jak na warunki boliwijskie. Początkowo partyzantom udało się wygrać kilka potyczek z regularną armią boliwijską. Latem 1967 roku rząd Boliwii rozpoczął akcję skierowaną przeciwko partyzantom, we wrześniu armii udało się rozbić dwie grupy partyzanckie, zabijając jednego z jej liderów. W rezultacie coraz mniej chłopów, na których liczył Che, zaciągało się do oddziału, rekrutacja ustała. Partyzantom nie udało się uzyskać wsparcia ze strony ruchów opozycyjnych w większych miastach. Che w pamiętniku napisał, że chłopi często donosili wojsku o położeniu oddziału.
31 sierpnia 1967 roku dziesięcioosobowa grupa rebeliantów wpadła w zasadzkę sił rządowych, wszyscy zostali zamordowani przez żołnierzy, wśród zabitych była Tama „Tania” Bunke. 8 października 1967 roku większość żołnierzy Guevary została otoczona i zabita przez wojsko. Guevara uważał, że okrucieństwa, jakich dopuszcza się armia boliwijska, wpłyną na ludność cywilną, która opowie się po stronie rebelii. Dokument z 2007 roku w reżyserii Kevina Macdonalda przedstawia argumenty na rzecz tezy, że nazistowski zbrodniarz wojenny Klaus Barbie, alias „Rzeźnik z Lyonu”, doradzał i ewentualnie pomógł CIA w schwytaniu Ernesto. W dniu 7 października informator zawiadomił boliwijskie siły specjalne o lokalizacji obozowiska w wąwozie Yuro, 8 października tysiąc osiemset żołnierzy otoczyło teren, a Guevara został ranny i wzięty do niewoli.
Che został związany i przywieziony do zrujnowanej szkoły w pobliskiej wiosce La Higuera w nocy 8 października. Boliwijski prezydent René Barrientos wydał rozkaz zamordowania Guevary. Chwilę przed egzekucją boliwijski żołnierz zapytał go, czy myśli o nieśmiertelności, na co Che odpowiedział: „Nie, myślę o nieśmiertelności rewolucji”. W sumie Che został postrzelony dziewięcioma kulami, pięć kul trafiło w nogi, jedna kula trafiła go w klatkę piersiową i gardło, a dwie pozostałe w ramiona. Przed śmiercią miał powiedzieć: Wiem, że przychodzisz mnie zabić. Strzelaj, masz tylko zabić człowieka. Wyrok wykonał sierżant Mario Terán.
